Research and Development: Applications

Oddziaływania białek z DNA pełnią kluczową rolę w procesach powielania, utrzymywania oraz ekspresji informacji genetycznej. W zależności od swojej funkcji komórkowej białka wiążą się z DNA w sposób niezależny od sekwencji (wiązanie niespecyficzne) lub wykazują istotne powinowactwo do konkretnych motywów sekwencyjnych (wiązanie specyficzne). W obecnym projekcie zamierzamy zbadać wybrane molekularne mechanizmy leżące u podstaw specyficznego i niespecyficznego wiązania się białek z DNA. W szczególności, chcemy zbadać w jakim stopniu za rozpoznawanie konkretnych motywów odpowiadać może zależne od sekwencji zróżnicowanie elastyczności podwójnej helisy DNA. Na podstawie licznych eksperymentów twierdzi się, że białka, których związanie do DNA wymaga istotnego wygięcia podwójnej helisy mają wyższe powinowactwo do sekwencji DNA, dla których taka deformacja jest energetycznie korzystniejsza. Wykorzystując metody "alchemicznej" predykcji różnic energii swobodnej w symulacjach dynamiki molekularnej w połączeniu z odpowiednimi cyklami termodynamicznymi zamierzamy zdekomponować całkowite powinowactwo wybranych białek do DNA na wkłady odpowiadające i) oddziaływaniu z zasadami i szkieletem fosfocukrowym, ii) zależnej od sekwencji deformacji elastycznej DNA, iii) zależnej od sekwencji desolwatacji DNA. Taka dekompozycja pozwoliłaby po raz pierwszy ilościowo ustalić udział niebezpośrednich czynników w rozpoznaniu sekwencji DNA. Ponadto mamy zamiar przetestować postawioną przez nas poprzednio hipotezę, wedle której wszystkie reszty aminokwasowe zaangażowane w rozpoznanie sekwencji DNA można podzielić na dwie grupy. Pierwsza z nich zwiększa absolutne powinowactwo białka do danej sekwencji poprzez obniżenie energii swobodnej wiązania białka z tą konkretną sekwencją (odpowiada ona zatem za tzw. "pozytywną" selekcję). Druga grupa z kolei zwiększa relatywne powinowactwo białka do danej sekwencji poprzez zwiększenie energii swobodnej wiązania do konkurencyjnych miejsc wiązania wzdłuż podwójnej helisy DNA (odpowiada zatem za tzw. "negatywną" selekcję, redukując powinowactwo do sekwencji nietargetowych). W założonym celu zamierzamy wykorzystać m.in. szereg technik przyspieszonego próbkowania w celu wyznaczenia wkładów do energii swobodnej wiązania pochodzących od poszczególnych reszt aminokwasowych.Trzecim elementem planowowanych badań jest zrozumienie molekularnych podstaw rozpoznawania przez helikazy z rodziny DEAH/RHA niekanonicznych motywów DNA typu G-kwadrupleksów. Helikazy te wykazują niezwykle silne powinowactwo do G-kwadrupleksów zarówno DNA jak i RNA a wykazując zdolność do ich rozwijania biorą udział w mediowanej przez G-kwadrupleksy kontroli transkrypcyjnej i post-transkrypcyjnej. Aby zrozumieć mechanizm rozpoznania G-kwadrupleksów przez helikazy typu DEAH/RHA wyznaczymy profile energii swobodnej dla wiązania wybranego G-kwadrupleksu o topologii równoległej z helikazą DHX36 oraz jej poszczególnymi domenami zaangażowanymi w oddziaływanie z cząsteczką kwasu nukleinowego.
Ze względu na konieczność precyzyjnej analizy specyficznych oddziaływań białko-DNA, wszystkie planowane obliczenia wymagają wykorzystania pełnoatomowej dynamiki molekularnej. Badane układy (z wodą traktowaną eksplicite) złożone będą z 40--200 tys. atomów, przez co ich wydajne pełnoatomowe symulacje dynamiki molekularnej wymagają zrównoleglonych wersji silników MD oraz zasobów obliczeniowych dostępnych wyłącznie w centrach komputerowych. Ponieważ skale czasowe odpowiadające wiązaniu białek do DNA o kilka rzędów przewyższają te dostępne dla pełnoatomowej dynamiki molekularnej, zachodzi konieczność stosowania kosztownych obliczeniowo metod przyspieszających próbkowanie przestrzeni konformacyjnej, takich jak umbrella sampling czy wymiana replik. Wszystkie symulacje dynamiki molekularnej prowadzone będą przy pomocy pakietu Gromacs.